一、保護(hù)劑與賦形劑開發(fā)

1. 保護(hù)劑開發(fā)

保護(hù)劑是凍干過程中防止活性組分變性失活的關(guān)鍵成分，其選擇和優(yōu)化直接影響凍干制品的質(zhì)量。大健康凍干制品保護(hù)劑開發(fā)需遵循以下原則：

l                      針對性篩選：根據(jù)大健康產(chǎn)品類型（如益生菌、植物提取物、膠原蛋白、納米制劑等）選擇合適的保護(hù)劑。

l                      實(shí)驗(yàn)方法：采用單因素篩選和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方式，確定最佳保護(hù)劑種類和濃度。例如，通過活菌計數(shù)法評估益生菌保護(hù)效果，通過粒度分析和包封率測定評估植物提取物保護(hù)效果，通過Zeta電位測定評估納米制劑穩(wěn)定性  。

l                      協(xié)同優(yōu)化：復(fù)合保護(hù)劑比單一成分效果更優(yōu)。研究表明，添加甘露醇可將制品塌陷溫度從-31℃提升至-24℃，從而縮短凍干時間，提高干燥效率。在益生菌凍干中，可溶淀粉和β?環(huán)糊精的保護(hù)效果較好，表現(xiàn)為外形飽滿無坍縮、色澤細(xì)膩白亮、復(fù)溶后無沉淀、活性成分無降解。

2. 賦形劑開發(fā)

賦形劑主要作用是支撐凍干制品的物理結(jié)構(gòu)，使其具有良好的形態(tài)和機(jī)械強(qiáng)度，便于轉(zhuǎn)移和儲存。

l                      常用賦形劑：甘露醇、麥芽糊精、乳糖、甘氨酸、海藻糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等，其中甘露醇在護(hù)膚品凍干中應(yīng)用廣泛，濃度通常在65%-68%(W/W)時可形成大小形態(tài)均一、吸濕性低的凍干微珠。

l                      篩選標(biāo)準(zhǔn)：需同時滿足物理支撐（如凍干珠成型、色澤均勻）和復(fù)溶效率要求（如復(fù)溶時間短、無沉淀），同時不影響復(fù)溶后的檢測或使用性能。

l                      協(xié)同開發(fā)：賦形劑與保護(hù)劑需協(xié)同優(yōu)化。例如，添加甘氨酸能提高生物制品的可塑性，提高制品的塌陷溫度，從而允許在一次干燥階段使用更高的擱板溫度，縮短凍干周期 。在護(hù)膚品凍干中，HA/PGA溶液的pH值調(diào)整至7，可獲得更好的凍干結(jié)構(gòu)和復(fù)溶性能  。

二、凍干樣品測試

凍干樣品測試是評估凍干工藝效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要包括以下方面：

1. 復(fù)溶效率測試

復(fù)溶效率直接關(guān)系到產(chǎn)品使用體驗(yàn)和功能性，測試指標(biāo)包括：

l                      復(fù)溶時間：記錄凍干樣品全部溶解所需時間，如羥基酪醇納米脂質(zhì)體凍干粉要求在1分鐘內(nèi)復(fù)溶成均勻懸浮液且無不溶顆粒或團(tuán)塊。

l                      復(fù)溶均勻性：通過目視觀察或儀器檢測樣品溶解后的均勻程度，如益生菌凍干粉復(fù)溶后應(yīng)無沉淀或團(tuán)塊。

l                      再分散性：評估凍干制品在復(fù)溶后的分散狀態(tài)，如納米制劑復(fù)溶后應(yīng)保持良好分散性，粒徑分布穩(wěn)定。

2. 活性保留率測試

活性保留率是評價凍干制品質(zhì)量的核心指標(biāo)，測試方法因產(chǎn)品類型而異：

l                      益生菌制品：通過活菌計數(shù)法測定凍干前后活菌數(shù)變化，計算公式為：存活率(%)＝(凍干后活菌數(shù)/凍干前活菌數(shù))×100%。

l                      植物提取物：通過高效液相色譜法(HPLC)測定凍干前后有效成分含量變化，如三七凍干制品中PNS和三七素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定。

l                      納米制劑：通過透射電鏡(TEM)觀察凍干前后納米粒子形態(tài)變化，通過Zeta電位測定評估凍干后穩(wěn)定性。

l                      護(hù)膚品：通過皮膚修復(fù)效果測定（如EGF凍干粉的修復(fù)效果）或經(jīng)皮透過率測定（如咖啡yin凍干面膜的經(jīng)皮透過率）評估凍干后活性保留。

3. 形態(tài)穩(wěn)定性測試

形態(tài)穩(wěn)定性影響凍干制品的物理性質(zhì)和儲存穩(wěn)定性：

l                      凍干顯微鏡觀察：實(shí)時監(jiān)測凍干過程中樣品結(jié)構(gòu)變化，評估塌陷溫度。

l                      掃描電鏡(SEM)分析：觀察凍干制品微觀結(jié)構(gòu)，如凍干珠的表面形貌和孔隙結(jié)構(gòu)。

l                      機(jī)械強(qiáng)度測試：評估凍干制品的抗壓強(qiáng)度和脆碎度，如凍干珠需通過抗壓測試確保在分裝過程中不易碎裂。

l                      水分含量與水分活度測定：采用卡爾費(fèi)休法測定水分含量，采用水分活度儀測定水分活度，確保產(chǎn)品水分含量≤3%，水分活度在0.03~0.1范圍內(nèi)。

三、凍干關(guān)鍵溫度測試

凍干關(guān)鍵溫度測試是確定凍干曲線的基礎(chǔ)，主要包括以下參數(shù)：

1. 共晶點(diǎn)測試

共晶點(diǎn)是指物料中水分全部凍結(jié)的溫度，是凍干工藝預(yù)凍階段的關(guān)鍵參數(shù)：

l                      DSC熱分析法：通過差示掃描量熱儀測定，如5-氮雜胞苷-D-甘露醇溶液的共晶點(diǎn)為-6.54℃。

l                      電阻法：當(dāng)物料冷凍溫度降至某一值，物料全部凍結(jié)，電阻突然增大，該溫度即為共晶點(diǎn)。

2. 共熔點(diǎn)測試

共熔點(diǎn)是指全部凍結(jié)的物料開始融化的溫度，是凍干工藝一次干燥階段的關(guān)鍵參數(shù)：

l                      DSC熱分析法：通過差示掃描量熱儀測定，如10% IMO溶液的共熔點(diǎn)為-2.6℃。

l                      凍干顯微鏡法：通過觀察凍干過程中樣品結(jié)構(gòu)變化，確定冰晶開始融化的溫度。

3. 玻璃化轉(zhuǎn)變溫度測試

玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg')是指無定形體系從玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橄鹉z態(tài)的溫度，是凍干工藝預(yù)凍和解析干燥階段的關(guān)鍵參數(shù)：

l                      DSC熱分析法：通過差示掃描量熱儀測定，如GGT試劑的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為-18.75℃。

l                      凍干顯微鏡法：通過觀察凍干過程中樣品結(jié)構(gòu)變化，確定溶質(zhì)相從玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橄鹉z態(tài)的溫度。

4. 塌陷溫度測試

塌陷溫度是指凍干制品干燥過程中失去剛性，開始變黏，發(fā)生類似塌方的崩解、融化或產(chǎn)生發(fā)泡現(xiàn)象的臨界溫度：

l                      凍干顯微鏡法：使用Linkam FDSC-196凍干顯微鏡系統(tǒng)，配有液氮冷卻系統(tǒng)、可編程溫度控制器和真空泵，以2℃/min速率升溫，觀察樣品結(jié)構(gòu)局部喪失時的溫度（Toc）和整體喪失時的溫度（Tfc）。

l                      介電分析法：通過介電性能的變化判定塌陷溫度。

l                      DSC與凍干顯微鏡結(jié)合法：通過凍干顯微鏡觀察樣品結(jié)構(gòu)變化，結(jié)合DSC測定的熱流曲線，確定塌陷溫度。

關(guān)鍵溫度測定示例：高活性益生菌發(fā)酵枸杞粉的凍干物性參數(shù)為：共融點(diǎn)-5.28℃，結(jié)晶點(diǎn)-19.59℃，玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度-31.82℃，崩解溫度約-36℃。基于這些參數(shù)，確定預(yù)凍溫度為-40℃，預(yù)凍時間為4小時，升華干燥階段的溫度為-30℃。

四、凍干曲線開發(fā)與優(yōu)化

基于關(guān)鍵溫度測試結(jié)果，設(shè)計凍干曲線，優(yōu)化升華和解析干燥階段的溫度與時間：

1. 凍干曲線設(shè)計原則

l                      預(yù)凍階段：需根據(jù)共晶點(diǎn)確定zui低溫度（通常低于共晶點(diǎn)10-20℃），并控制降溫速率（速凍或慢凍）。例如，益生菌發(fā)酵枸杞漿的預(yù)凍溫度為-40℃，預(yù)凍時間為4小時，確保物料完quan凍結(jié)。

l                      一次干燥（升華干燥）：溫度需低于共熔點(diǎn)（如-5.28℃）但高于塌陷溫度（如-36℃），真空度控制在10-30 Pa，升溫速率通常為2℃/min。如豬瘟耐熱活疫苗凍干升華溫度設(shè)為-30℃，低于共熔點(diǎn)-27.51℃但高于塌陷溫度-31℃。

l                      二次干燥（解析干燥）：需緩慢升溫至高于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（如-31.82℃），確保殘留水分徹di去除。例如，甘草酸脂質(zhì)體凍干解析干燥溫度設(shè)為25℃，高于Tg'-17℃。

2. 凍干曲線優(yōu)化策略

l                      數(shù)學(xué)模型應(yīng)用：利用凍干傳熱傳質(zhì)模型（如Page模型、有限元模型）預(yù)測凍干過程，減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)。例如，蕨菜凍干過程通過Page模型預(yù)測水分變化，縮短開發(fā)周期。

l                      實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：通過壓力升測試、板溫均勻性驗(yàn)證等方法確認(rèn)凍干終點(diǎn)。例如，利福平凍干粉針劑通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化凍干曲線，確定最佳參數(shù)為預(yù)凍溫度-40℃，升華干燥溫度-12℃，再干燥溫度40℃。

l                      參數(shù)調(diào)整邏輯：

n                      預(yù)凍階段：溫度需低于共晶點(diǎn)10-20℃，保溫時間需足夠消除溫度差，使樣品內(nèi)外層溫度達(dá)到一致。

n                      升華階段：溫度控制在共熔點(diǎn)與塌陷溫度之間，若溫度高于共熔點(diǎn)則產(chǎn)品會融化，出現(xiàn)干縮現(xiàn)象；若溫度低于塌陷溫度則升華速率降低，延長干燥時間。

n                      解析階段：溫度需高于Tg'以去除結(jié)合水，時間通常為升華階段的1/3，當(dāng)樣品溫度與擱板溫度趨于一致時為干燥結(jié)束。

凍干曲線優(yōu)化示例：豬瘟耐熱活疫苗通過測定共晶點(diǎn)(-27.51℃)和塌陷溫度(-24.3℃)，設(shè)計凍干曲線，成功將凍干時間縮短至24小時，凍干和耐熱損失分別降至0.30 lg和0.45 lg，優(yōu)于傳統(tǒng)工藝。

五、生產(chǎn)放大方案設(shè)計

從小批量到大批量的生產(chǎn)放大是大健康凍干制品開發(fā)服務(wù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需考慮以下因素：

1. 小試生產(chǎn)（實(shí)驗(yàn)室級）

l                      設(shè)備選擇：0.1㎡凍干面積的凍干機(jī)，如LGJ-18C型凍干機(jī)，適用于小規(guī)模研發(fā)和驗(yàn)證。

l                      工藝驗(yàn)證：通過壓力升測試、板溫均勻性驗(yàn)證等方法確認(rèn)凍干終點(diǎn)，驗(yàn)證凍干曲線合理性。

l                      樣品測試：重點(diǎn)測試凍干制品的活性保留率、復(fù)溶效率和形態(tài)穩(wěn)定性，為中試生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2. 中試生產(chǎn)（中試級）

l                      設(shè)備升級：1㎡凍干面積的凍干機(jī)，如LYO-20型凍干機(jī)，適用于中等規(guī)模生產(chǎn)驗(yàn)證。

l                      工藝參數(shù)調(diào)整：根據(jù)放大效應(yīng)調(diào)整凍干曲線，如注射用尿促性素的凍干工藝參數(shù)優(yōu)化，將凍干周期由原來的22小時縮短至18.5小時。

l                      批次一致性驗(yàn)證：通過多批次測試確保產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，如凍干珠的裝量差異控制在±3%以內(nèi)，活性成分保留率波動控制在±5%范圍內(nèi)。

l                      質(zhì)量控制體系建立：建立完整的質(zhì)量控制流程，包括原液質(zhì)量控制、灌裝過程控制、凍干過程監(jiān)控和成品檢測等。

3. 大批量生產(chǎn)（工業(yè)級）

l                      設(shè)備選型：5㎡凍干面積的工業(yè)級凍干機(jī)，需滿足GMP合規(guī)要求，如冷阱溫度≤-60℃，極限真空度≥15 Pa，板溫均勻性良好（溫差<2℃）。

l                      工藝優(yōu)化：采用數(shù)學(xué)模型（如等效阻力模型、有限元模型）指導(dǎo)工藝參數(shù)調(diào)整，減少放大實(shí)驗(yàn)次數(shù)。

l                      質(zhì)量控制：建立全面的質(zhì)量控制體系，包括原液質(zhì)量控制、灌裝過程控制、凍干過程監(jiān)控（如擱板溫度、真空度、產(chǎn)品溫度）和成品檢測（如活性成分保留率、水分含量、復(fù)溶效率）等。

l                      驗(yàn)證方法：采用分層涂布工藝或非飽和多孔介質(zhì)技術(shù)，結(jié)合響應(yīng)面法確定參數(shù)可接受范圍，確保放大后產(chǎn)品質(zhì)量一致。

生產(chǎn)放大示例：咖啡yin面膜凍干工藝通過Hunter方法和星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化分層涂布冷凍干燥參數(shù)，確定涂布層數(shù)、層厚和涂布速度的可接受范圍分別為2-4層、0.5-1.2mm和1-5 m/min，最好結(jié)果分別為3層、0.5mm和3mm。優(yōu)化工藝后制備的3批面膜中咖啡yin20分鐘透過率均超過10%，實(shí)現(xiàn)了從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)生產(chǎn)的成功放大  。